问题分析：基因的扩增效率降低导致Ct值偏大；基因本身的转录水平低导致的Ct偏大；

解决方法：可将基因的扩增产物进行梯度稀释，同时进行 qPCR，将得到的标准曲线进行引物扩增效率的计算。通过标准曲线可以得到线性方程，将线性方程得到的斜率(K)带入扩增效率计算公式中：e=10[-1/k]-1；只有当扩增效率满足90~120%，且标准曲线R2 ≥ 0.99，引物的扩增效率才是合格的，定量出来的Ct值才可以用来计算，且扩增效率越接近100%，引物的扩增性能越优；若判断为扩增效率较低，主要为反应条件不适宜或者引物设计不合理，应重新优化反应体系或者引物设计。

基因本身的转录水平低可以适当提高上样模板的量以降低Ct值在合理的范围之内。

4、没有荧光信号

可能原因及解决方法：

A 没有信号采集步骤：每个扩增循环结束后，设置收集步骤;

B 体系蒸发：用专用的高质量8联排管盖或用封膜仪封板。

C 没有扩增： 可通过2%琼脂糖凝胶电泳对qPCR产物进行跑胶检测（120v,20min左右），看是否有条带。如果没有条带或者条带弥散，可能是引物或模板有问题，也可能是基因表达量太低。

D 模板浓度太低：如果内参没有有信号或内参CT值大于25，说明浓度太低。或者模板存在PCR抑制剂，建议重新制样后再检测。

二、扩增曲线问题

1、扩增曲线无法达到平台期

原因分析：基因丰度较低。

解决方法：增加循环数或者增加上样的模板量，或选择适用于低丰度模板的试剂盒。

2.扩增曲线平台期下降

原因分析：模板量过高及基线设置不当。

解决方法：减小基线的终点值，一般情况下选择Ct-4；

3.平台期锯齿状

原因分析：RNA纯度低，杂质所造成的干扰；仪器需要校准；

解决方法：增加稀释倍数优化反应，或者重新制备高纯度的RNA模板；

校准仪器即可；

4.扩增曲线杂乱无规律

原因分析：可能是ROX浓度和机型不匹配，建议调整ROX浓度；一般情况下所购买的试剂ROX的配比已经是调整好的，只需要按照说明进行配置qPCR反应体系和上机的操作。

解决方法：可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看扩增曲线是否恢复正常，即可判定是否是ROX导致的。

5. 有溶解曲线无扩增曲线

原因分析：反应程序问题，扩增阶段未收集荧光信号；

解决方法：检查程序设置；

6.反应结束无扩增曲线出现

原因分析：反应循环数不够；程序中未设置采集荧光信号步骤；模板量太低；

解决方法：增加循环数，一般设置到40即可；检查qPCR反应程序，添加荧光信号采集步骤；可能为目的基因的含量低导致，可用高浓度的上样量进行试验，或者重新提取模板进行试验；

7. 复孔的扩增曲线平台期不一致

原因分析: 主要由于复孔之间的细小差距导致的平台期的荧光信号差异较大;模板多加或少加。

解决方法： 确保准确加样，复孔之间 只要ΔCt